In de moleculaire biologie kan goede bufferkeuze en voorbereiding voor verschillende DNA-isolatiestappen het verschil zijn tussen overgaan naar eiwitexpressie of het openen van een andere maxi-prep-kit om opnieuw te beginnen. Ondanks hun cruciale belang zijn bufferrecepten vaak precies dat - recepten geschreven zonder uitleg of reden voor de verschillende componenten. Eén zo'n buffer is glucose-tris-EDTA of GTE-buffer.
$config[code] not foundWaarvoor wordt GTE gebruikt?
GTE wordt gebruikt om pellets van bacteriële cellen opnieuw te suspenderen voorafgaand aan het lyseren (openbreken) van de cellen en het binnenin het plasmide-DNA verzamelen. Lysozyme, dat de celmembranen verzacht, wordt vaak toegevoegd samen met de GTE-buffer. Het bereiken van een homogene suspensie van hele cellen tijdens deze stap zodat de daaropvolgende toegevoegde lysisoplossing bij alle cellen kan komen, is de sleutel tot het verkrijgen van goede DNA-opbrengsten. GTE is ontworpen om dit te doen en biedt tegelijkertijd een stabiele omgeving voor het DNA.
Glucose voor osmolariteit
50 mM (millimolaire) glucosesuiker wordt toegevoegd aan GTE-buffer om de osmolariteit te behouden wanneer de opgeloste concentratie buiten de cellen dicht bij die in de cellen ligt. Dit voorkomt voortijdige cellysis, die lagere DNA-opbrengsten kan veroorzaken als gevolg van aggregatie en degradatie. De andere componenten van de buffer dragen ook bij tot de osmolariteit van de oplossing, maar glucose, dat een niet-elektrolyt is, is een goede keuze omdat het de buffereigenschappen van de oplossing niet verstoort.
Tris voor pH-stabiliteit
Tris is de korte naam voor tris (hydroxymethyl) aminomethaan, wat een zeer algemene pH-buffer is. In het geval van GTE-buffer wordt het zure zout (Tris-HCl) aan de buffer toegevoegd in een concentratie van 25 mM. Dit handhaaft de pH van de oplossing op een bijna fysiologische 8,0, een ideale pH voor het voorkomen van zure hydrolyse (afbraak) van het plasmide-DNA en ongewenste nevenreacties van de andere celcomponenten.
EDTA Voorkomt DNA-afbraak
EDTA, of ethyleendiaminetetra-azijnzuur, vangt of "cheleert" metaalionen uit de oplossing, waardoor ze niet kunnen deelnemen aan ongewenste nevenreacties. In GTE-buffer wordt EDTA bij 10 mM toegevoegd. Het primaire doel is in de buffer om vrij zink, magnesium en calcium op te vangen, waardoor de afbraak van DNA door bepaalde paden die deze metalen vereisen, wordt voorkomen.
Enkele belangrijke tips
Houd uw GTE-buffer koud en maak deze in kleine hoeveelheden om de groei van onbedoelde bacteriën te voorkomen. Suiker en de gecontroleerde pH zorgen voor een geweldig groeimedium. Gebruik altijd gezuiverd water. Kraanwater kan een overmaat aan metaalionen uit de leidingen hebben, wat het vermogen van de EDTA om te vangen kan overbelasten. Als u de aanwezigheid van interfererend RNA in uw monster vermoedt, voeg dan RNase A bij 100 microgram per milliliter toe aan uw GTE-buffer om het probleem te verhelpen.
